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WesternBlot原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS-PAGE可對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個(gè)印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結(jié)合位點(diǎn)。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標(biāo)蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過(guò)的NC膜再用標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。
(一)配膠
1.將玻璃板洗凈，zui后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
2.分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡），加入10%AP及TEMED即可。
3.封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后靜置至膠凝固。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力清除殘留水滴。
4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)防止氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。30min后上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。(10%的AP現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過(guò)兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉)
(二)樣品處理
1.培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：
1)去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
2)對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每孔加200~300uL，60~80℃的1×loadingbuffer。
3)用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex2~3次。
4)用干凈的針尖挑絲，將團(tuán)塊棄掉，如果沒(méi)有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無(wú)團(tuán)塊也無(wú)絲狀物但溶液有些粘稠，可通過(guò)使用1ml注射器反復(fù)抽吸來(lái)降低溶液粘滯度，便于上樣。
5)待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。
2.培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：
1)去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
2)加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3)用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。
4)12000g離心，4℃，2min。
5)取少量上清進(jìn)行定量。
6)將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3.組織：
1)心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動(dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
2)12000g離心，4℃，2min。
3)取少量上清進(jìn)行定量。
4)將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低溫儲(chǔ)存，每次上樣前98℃，3min。
(三)電泳
1)所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loadingbuffer調(diào)整至與樣品等體積。
2)以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳。
3)在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。
（四）轉(zhuǎn)膜
1.電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開(kāi)始準(zhǔn)備：
濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去離子水至1000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入180ul10%SDS。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，待其自然吸水后再*浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。
2.取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠，左上切角，在轉(zhuǎn)移液中浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與膜每側(cè)的一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。用玻棒逐出氣泡后剪去濾紙與膜的過(guò)多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）。
3.轉(zhuǎn)膜：
濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過(guò)夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過(guò)1V/cm2膠面積。
電轉(zhuǎn)液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封閉及雜交
1)封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，放于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。
2)結(jié)合一抗：將含有一抗的封閉液滴加在搖床的塑料膜上，從封閉液中取出Western膜，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要產(chǎn)生氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4℃靜置過(guò)夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過(guò)多蒸發(fā)。
3)洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4)結(jié)合二抗：選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋?zhuān)?:1000~1:10000），室溫輕搖一小時(shí)。
5)洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
(六)發(fā)光鑒定
1.HRP-ECL發(fā)光法：
將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。
2.AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè)EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過(guò)的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果暴光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半小時(shí)，出現(xiàn)背景是正常的。
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