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細(xì)胞污染的類型
一、細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是實驗室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染。 一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。zui常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。
培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變而呈現(xiàn)黃色。也有的 培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，zui后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細(xì)胞株(系)丟失。一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。
二、真菌污染
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。zui常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間（發(fā)生卵圓形物體污染的幾率很大）。個體細(xì)小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。
三、支原體污染
支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨立生活的zui小微生物，zui小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。
培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。
四、病毒污染
采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
五、非同種細(xì)胞污染
由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實驗宣告無效。
非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
污染來源及鑒別
一、污染來源
細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：
1、不潔的動物組織標(biāo)本
很多動物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細(xì)菌，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌，造成細(xì)胞污染。
2、空氣
空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時不帶口罩或外界氣流過強，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不*也會引入微生物和有毒物質(zhì)。
4、操作
來自操作者的污染主要有以下幾方面：
1、器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時隔已久又末重新處理。
2、操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。
3、培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。
4、操作者不當(dāng)心，動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。
5、細(xì)胞傾液時倒出培養(yǎng)瓶或者滴落在超凈臺上，未及時擦凈或者灼燒。 6、灼燒的火不夠旺。
7、移液管吸取液體時將空氣中的氣流吸入培養(yǎng)瓶中。
8、長時間的將離心管放在離心機中，可能由于口沒有*封閉而造成污染。
9、同一根吸管或者放置吸管的離心管長時間使用造成的一管污染多瓶細(xì)胞交叉污染。
10、操作者操作時大聲說話，來回走動揚起灰塵等。
5、血清，市售血清滅菌不*，潛在病毒和支原體污染。
二、污染的鑒別
1、細(xì)菌、真菌污染的檢測
（1）肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
（2）鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。
（3）接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 2、支原體污染的檢測 （1）相差顯微鏡觀察 將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支持物(一般用長形蓋玻片)，24小時后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。
（2）熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色試劑，染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 （4）電鏡檢測 可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法。
（5）培養(yǎng)檢測 將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。
培養(yǎng)加熒光核染色是檢測支原體污染的黃金搭檔。
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